Instagram

1-677-124-44227

Kto?

Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Diagnostyki Mikrobiologicznej

Badanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej preparatu o różnych rozcieńczeniach cząsteczek nanosrebra.

Zleceniodawca

Broadway Beauty Sp. z o.o. Spółka Komandytowa, ul. Mikołowska 150, 40-592 Katowice, NIP 8992802390, REGON 365863362, Żaneta Stanisławska – Prezes Zarządu Komplementariusza.
Metoda pobrania próbek i sposób ich dostarczenia
Roztwory nanosrebra pobrał i dostarczył Zleceniodawca.
Charakterystyka badanych próbek
Próbki dostarczone zostały do laboratorium w trzech butelkach z dozownikiem o pojemności 250 ml. Na opakowaniach oznaczono rozcieńczenie roztworu nanosrebra: 10-krotnie rozcieńczony, 20-krotnie rozcieńczony i 100-krotnie rozcieńczony. Zleceniodawca nie określił stężenia cząsteczek nanosrebra w przekazanych do badania próbkach.
Data rozpoczęcia badania: 8.03.2018 r.
Data zakończenia badania: 31.03.2018 r.
Data przygotowania raportu badania: 5.04.2018 r.

Co?

Nanosilver solution diluted 100 times, 20 times, 10 times

Cel badania

Celem badania było sprawdzenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej dostarczonych roztworów nanosrebra. Aktywność tę określano odsetkiem redukcji liczby zdolnych do wzrostu drobnoustrojów testowych po określonym czasie kontaktu z badaną próbką, w stosunku do liczby drobnoustrojów w próbie kontrolnej, niepoddanej działaniu roztworu nanosrebra.

Metoda badania

Badanie wykonano metodą zawiesinową, z trzema rozcieńczeniami roztworu nanosrebra. Był to roztwór: 100-krotnie, 20-krotnie i 10-krotnie rozcieńczony. W badaniach użyto czterech wzorcowych patogenów człowieka: trzech bakteryjnych – Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 i jednego grzybowego – Candida albicans ATCC 10231. Czas kontaktu badanego preparatu z drobnoustrojami testowymi wynosił: 30 minut, 1 godzinę i 3 godziny. Badanie wykonano zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP ang. Good Laboratory Practice).

Przechowywanie szczepów testowych

Szczepy testowe były wyjściowo przechowywane w probówkach do głębokiego mrożenia (kriofiolkach), w zamrażarce, w temperaturze -80oC.

Podłoża mikrobiologiczne i odczynniki wykorzystane w badaniach

Podłoże TSA (Trypticase Soya Agar) (OXOID)
Podłoże Sabouraud z chloramfenikolem i gentamicyną (Sabouraud Dextrose Agar with chloramphenicole and gentamicin) (OXOID)
MacConkey Agar (OXOID) – do kontroli szczepu E.coli
Cetrimide Agar (OXOID) – do kontroli szczepu P.aeruginosa
Columbia Agar with 5% Sheep Blood (OXOID) – do kontroli szczepu S.aureus
Jałowy buforowany roztwór soli fizjologicznej – PBS ( BIOMED) – rozcieńczalnik

Przygotowanie zawiesin szczepów testowych

W celu przygotowania roboczej hodowli bakterii i grzybów pobierano inokulum z hodowli wyjściowej w kriofiolkach, posiewano na podłoże TSA dla bakterii i podłoże Sabouraud z chloramfenikolem i gentamicyną dla grzybów, a następnie inkubowano w temperaturze 35oC, prze 24 godziny bakterie oraz 48 godzin C. albicans. Po podanym czasie inkubacji przygotowywano w ten sam sposób drugą hodowlę, korzystając z pierwszej. Otrzymana druga hodowla była hodowlą roboczą, użytą w doświadczeniach. W celu kontroli charakterystycznych cech testowych szczepów bakteryjnych posiewane je równolegle na podłoża diagnostyczne: MacConkeyAgar, Cetrimide Agar, Columbia Agar with 5% Sheep Blood.

Przygotowanie zawiesiny testowej poszczególnych bakterii oraz grzybów, polegało na pobraniu za pomocą ezy z kolonii z wyrosłych hodowli drobnoustrojów i przeniesieniu do probówek z rozcieńczalnikiem (PBS). Zawartość probówek intensywnie mieszano używając wstrząsarki elektromechanicznej Vortex. Otrzymane w ten sposób zawiesiny drobnoustrojów standaryzowano według skali McFarlanda tak, aby zawiesiny bakteryjne zawierały 1x 107–1 x 108 cfu/ml, a zawiesina C.albicans 1x 106–1 x 107 cfu/ml. Aby policzyć dokładnie ilość cfu/ml w testowych zawiesinach bakterii, przygotowywano rozcieńczenia 105 i 106 w roztworze PBS, następnie pobierano po 0,1 ml z każdego rozcieńczenia i posiewano powierzchniowo na podłoże TSA. W celu policzenia ilości cfu/ml w testowej zawiesinie grzybów, przygotowywano rozcieńczenia 103 i 104 w roztworze PBS, a następnie pobierano po 0,1 ml z każdego rozcieńczenia i posiewano powierzchniowo na podłoże Sabouraud z chloramfenikolem i gentamicyną.

Pożywki inkubowano w temperaturze 35oC, przez 24 godziny bakterie oraz 48 godzin C. albicans, a następnie liczono wyrosłe kolonie i określano liczbę jednostek wzrostowych tworzących kolonie w 1 ml (cfu/ml) w każdej z testowych zawiesin drobnoustrojów. Dla każdego szczepu testowego zapisywano liczbę cfu/ml w wyjściowej zawiesinie i po procedurze badania działania przeciwdrobnoustrojowego roztworów nanosrebra. Następnie wyliczano odsetek redukcji liczby zdolnych do wzrostu komórek bakterii i grzybów.

Jak?

The course of the laboratory test and great results

Przebieg badania

Inokulum, w objętości 1 ml, każdego ze szczepów testowych dodawano do 9 ml badanych rozcieńczeń roztworu nanosrebra. Tak przygotowane próbki mieszano na wstrząsarce Vortex i po upływie odpowiednio: 30 minut, 1 godziny oraz trzech godzin pobierano 0,1 ml i posiewano powierzchniowo na podłoże TSA (dla bakterii) i na podłoże Sabouraud z chloramfenikolem i gentamycyną dla grzybów. Próbę kontrolną stanowiła zawiesina szczepu testowego w roztworze PBS. Wykonane posiewy inkubowano w temperaturze 35oC, przez 24 godziny (dla bakterii) i 48 godzin dla grzybów. Po inkubacji liczono wyrosłe kolonie. Badania wykonano w 3-krotnym powtórzeniu. Wynik badania stanowi średnią arytmetyczną z otrzymanych wyników.

Wyniki badań

Wpływ badanego roztworu nanosrebra na wzrost szczepu Staphylococcus aureus ATCC 6538
Wyniki badań wykazały, że 30 minutowy kontakt każdego z rozcieńczeń badanego roztworu nanosrebra z komórkami szczepu S. aureus ATCC 6538 powodował bardzo duży odsetek redukcji zdolnych do wzrostu bakterii. Trzygodzinny kontakt bakterii z roztworem nanosrebra w rozcieńczeniu 100-krotnym w 96,75% redukował ilość zdolnych do wzrostu komórek. Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek po ich 3 godzinnym kontakcie z roztworem nanosrebra w rozcieńczeniu 20 i 10-krotnym przekroczył 99 %. Otrzymane wyniki badań zestawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek Staphylococcus aureus ATCC 6538 po określonym czasie kontaktu z różnymi rozcieńczeniami badanego roztworu nanosrebra.

Czas kontaktu preparatu z zawiesina bakterii Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek (%)
Roztwór nanosrebra rozcieńczony 100 -krotnie Roztwór nanosrebra rozcieńczony
20 -krotnie
Roztwór nanosrebra rozcieńczony
10 -krotnie
30 minut 95,50 98 98, 03
1 godzina 96,00 98,90 98,50
3 godziny 96,75 99,25 99,33

 

Wpływ badanego roztworu nanosrebra na wzrost szczepu Escherichia coli ATCC 8739 Badania pokazały, że już 30 minutowy kontakt bakterii z roztworem nanosrebra w rozcieńczeniu 20- i 10- krotnym powodował całkowitą (100%) redukcję zdolnych do wzrostu komórek E. coli ATCC 8739. Trzygodzinny kontakt bakterii z preparatem w rozcieńczeniu 100-krotnym w 99,80% redukował ilość zdolnych do wzrostu komórek. Otrzymane wyniki badań zestawiono w tabeli 2.

 

Tabela 2. Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek Escherichia coli ATCC 8739 po określonym czasie kontaktu z rozcieńczeniami badanego roztworu nanosrebra.

Czas kontaktu preparatu z zawiesina bakterii Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek (%)
Roztwór nanosrebra rozcieńczony 100 -krotnie Roztwór nanosrebra rozcieńczony
20 -krotnie
Roztwór nanosrebra rozcieńczony
10 -krotnie
30 minut 96,88 100 100
1 godzina 98,90 100 100
3 godziny 99,80 100 100

 

Wpływ badanego roztworu nanosrebra na wzrost szczepu Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Badania wykazały, że już 30 minutowy kontakt bakterii z roztworem nanosrebra w rozcieńczeniu 20- i 10- krotnym powodował całkowitą (100%) redukcję zdolnych do wzrostu komórek P. aeruginosa ATCC 9027. Trzygodzinny kontakt bakterii z roztworem w rozcieńczeniu 100-krotnym w 99,90% redukował ilość zdolnych do wzrostu komórek. Otrzymane wyniki badań zestawiono w tabeli 3

Tabela 3. Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 po określonym czasie kontaktu z rozcieńczeniami badanego roztworu nanosrebra.

 

Czas kontaktu preparatu z zawiesina bakterii Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek (%)
Roztwór nanosrebra rozcieńczony 100 -krotnie Roztwór nanosrebra rozcieńczony
20 -krotnie
Roztwór nanosrebra rozcieńczony
10 -krotnie
30 minut 99,11 100 100
1 godzina 99, 52 100 100
3 godziny 99,90 100 100

 

Wpływ badanego roztworu nanosrebra na wzrost szczepu Candida albicans ATCC 10231
Badania dowiodły, że już 30 minutowy kontakt C. albicans ATCC 10231 z roztworem nanosrebra w rozcieńczeniu 20- i 10-krotnym powodował całkowitą redukcję (100%) zdolnych do wzrostu komórek. Trzygodzinny kontakt preparatu w rozcieńczeniu 100- krotnym z komórkami grzyba w 99,70% redukował ilość zdolnych do wzrostu komórek. Otrzymane wyniki badań zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4. Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek Candida albicans ATCC 10231 po określonym czasie kontaktu z rozcieńczeniami badanego roztworu nanosrebra.

 

Czas kontaktu preparatu z zawiesina grzyba Odsetek redukcji zdolnych do wzrostu komórek (%)
Roztwór nanosrebra rozcieńczony 100 -krotnie Roztwór nanosrebra rozcieńczony
20 -krotnie
Roztwór nanosrebra rozcieńczony
10 -krotnie
30 minut 82,00 100 100
1 godzina 87,00 100 100
3 godziny 99,70 100 100

Wnioski

Najefektywniejszy w redukcji zdolnych do wzrostu komórek patogennych szczepów testowych (S. aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa ATTC 9027 i C. albicans ATCC 10231) okazał się badany roztwór nanosrebra w rozcieńczeniu 20- i 10-krotnym. Już 30 minutowy kontakt roztworu nanosrebra w tych rozcieńczeniach z komórkami szczepów testowych (bakterii i grzybów) powodował całkowitą redukcję (100%) zdolnych do wzrostu komórek. Trzygodzinny kontakt badanych roztworów nanosrebra w rozcieńczeniu 100-krotnym nie powodował całkowitej redukcji zdolnych do wzrostu komórek szczepów testowych. Jednak odsetek redukcji komórek był bardzo wysoki i w zależności od szczepu testowego wynosił odpowiednio: 96,75% dla S.aureus; 99,70% dla C.albicans; 99,80% dla E.coli; 99,90% dla P.aeruginosa.

Badanie wykonali:
Dr n. farm. Dr n. farm. Specjalista farmacji aptecznej Specjalista mikrobiologii Paweł Lisiecki Bożena Dudkiewicz